实时荧光定量 PCR 仪如何检测肉类微生物

        实时荧光定量 PCR 仪检测肉类微生物主要基于聚合酶链式反应（PCR）技术，并结合荧光检测方法，能够对肉类中的微生物进行定性和定量分析，具体操作步骤如下：

        样品采集与处理：从肉类样品的不同部位采集适量样本，放入无菌容器中。将采集的样品进行均质处理，使微生物均匀分散在溶液中。然后采用合适的核酸提取方法，如试剂盒法，从样品中提取微生物的核酸（DNA 或 RNA）。对于 RNA 病毒等含 RNA 的微生物，还需要进行逆转录过程，将 RNA 转化为 cDNA。

        引物和探针设计：根据目标微生物的特定基因序列，设计特异性的引物和荧光探针。引物是一段短的 DNA 序列，能够与目标基因的两端互补配对，引导 DNA 聚合酶进行扩增；荧光探针则是一段与目标基因中间部分互补的寡核苷酸，两端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团。当探针完整时，荧光报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；而当探针被降解时，荧光报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。

        配制反应体系：在 PCR 反应管中依次加入适量的模板核酸（提取的微生物核酸或 cDNA）、引物、荧光探针、DNA 聚合酶、dNTPs（脱氧核苷三磷酸）、缓冲液等，组成 PCR 反应体系。确保各成分的浓度和比例合适，以保证 PCR 反应的顺利进行。

        设置反应条件：将 PCR 反应管放入实时荧光定量 PCR 仪中，设置合适的反应程序。一般包括预变性步骤，使 DNA 双链解开；然后进行多个循环的变性、退火和延伸步骤。变性是使 DNA 双链分离，退火是让引物与模板 DNA 结合，延伸是在 DNA 聚合酶的作用下合成新的 DNA 链。在每个循环的延伸阶段，荧光探针会被 DNA 聚合酶降解，释放出荧光信号，实时荧光定量 PCR 仪会实时监测荧光信号的强度。

        数据分析与结果判断：随着 PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。实时荧光定量 PCR 仪会自动记录每个循环的荧光值，并生成扩增曲线。通过分析扩增曲线的 Ct 值（循环阈值，即荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数），可以对目标微生物进行定性和定量分析。一般来说，Ct 值越小，说明样品中目标微生物的核酸含量越高。同时，通过与已知浓度的标准品的扩增曲线进行比较，还可以计算出样品中目标微生物的具体数量。如果样品的扩增曲线呈现典型的 S 型曲线，且 Ct 值在合理范围内，则判定样品中存在目标微生物；如果没有扩增曲线或 Ct 值大于设定的阈值，则判定样品中不存在目标微生物或微生物含量低于检测限。

        实时荧光定量 PCR 仪检测肉类微生物具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，能够快速准确地检测出肉类中可能存在的致病菌、腐败菌等微生物，为肉类食品安全提供有力保障。

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